如何利用28色方案，讓樹突狀細(xì)胞分群更精細(xì)

為什么要研究樹突狀細(xì)胞？

T和B淋巴細(xì)胞是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的基本效應(yīng)細(xì)胞，但APC（抗原遞呈細(xì)胞）作為其上游，起著守門員的角色，幾乎可以啟動和塑造任何適應(yīng)性免疫反應(yīng)。樹突狀細(xì)胞（DC）就是APC中遞呈抗原能力ZUI強(qiáng)的一種。
越來越多的證據(jù)表明，DC對于致耐受性或促炎性局部免疫環(huán)境是至關(guān)重要的，因此，在自身免疫性疾病以及癌癥等疾病中，將DC的生物學(xué)機(jī)制研究清楚，就可能揭示治療干預(yù)的新方法。

那么如何精細(xì)分出DC亞群呢？

在過去的十年中，小鼠和人類樹突狀細(xì)胞分類逐漸細(xì)化，這在很大程度上得益于流式細(xì)胞術(shù)和單細(xì)胞RNA測序（sc-RNAseq）領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展。
在此，我們根據(jù)新的基于sc-RNAseq的分類，設(shè)計(jì)了28色方案來深入?yún)^(qū)分人DC亞群。大致思路如下：

1. 采用CD45以在非淋巴組織樣品中區(qū)分造血細(xì)胞與污染的基質(zhì)細(xì)胞。

2. 為區(qū)分DC亞群，用CD11c、HLA-DR、CD141（也稱為BDCA-3，標(biāo)記cDC1）、CD1c（BDCA-1，標(biāo)記cDC2）和CD123（pDC）。

3. 增加15個表面分子，每個表面分子與炎癥性疾病或抗腫瘤免疫的DC功能相關(guān)：共刺激分子CD40、CD80和CD86；低親和力Fc-受體CD16（FccrIIIa）和CD32（FccrIIa/b）；趨化因子受體CCR7和CX3CR1；清道夫受體CD163；補(bǔ)體受體CD11b；CD85k（也稱為ILT-3）；BTLA（CD272，也稱為B和T淋巴細(xì)胞衰減分子）；CD26，CD38和CD172（也稱為Sirpa）。

4. 為了更地圈門，加上了排除性的譜系標(biāo)記物CD3（pan T細(xì)胞）、CD14（經(jīng)典單核細(xì)胞）、CD19（B細(xì)胞）、CD56（NK細(xì)胞）以及CD4和CD8。

5. 結(jié)合CCR7和CD45RA，該方案同時可評估T細(xì)胞亞群的分化狀態(tài)。值得注意的是，CCR7也被證明是DC向引流淋巴結(jié)遷移所必需的。

?詳細(xì)

?分析步驟詳解

步，首先是常規(guī)的圈取液流穩(wěn)定部分、選擇單個核細(xì)胞區(qū)域、排除粘連體、圈選CD45+活細(xì)胞區(qū)域。

第二步，通過CD16/CD14，圈出CD14+單核細(xì)胞和CD14-細(xì)胞，接著將CD14-細(xì)胞顯示在CD19/CD3圖上，圈出CD3+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、CD3-CD19-細(xì)胞，在這里CD3+T可通過CD4/CD8分為CD4+T、CD8+T、DNT三個主要亞群;

對CD4+T和CD8+T兩個亞群，可進(jìn)一步通過CCR7和CD45RA圈出其中Naive功能狀態(tài)的亞群；而CD19+B細(xì)胞則可繼續(xù)分析其CD80+的比例。

第三步，對第二步中圈出的CD14-CD3-CD19-部分細(xì)胞，進(jìn)一步用CD56/CD123散點(diǎn)圖分析，圈出CD56+NK、CD123高表達(dá)的pDC、CD56-CD123low的DC候選群體，接著可根據(jù)CD11c/HLA-DR，圈出準(zhǔn)確的雙陽性DC群體，后根據(jù)CD141/CD1c分析DC（不包括pDC）中的三個亞群：CD141+DC、CD1c+DC、DN DC。

第四步，分析pDC、CD141+DC、CD1c+DC、DN DC四個亞群中CD26、BTLA、CD32、CD38、CX3CR1、CD85k、CD11b、sirpa、CD40、CD86、CD45RA的表達(dá)水平。

后一步，利用FMO作為設(shè)門對照，分析總DC中CX3CR1、CD85k、CD40、CD163、CD86的表達(dá)水平。

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